前沿拓展：

冰凍切片免疫組化抗原抗體結合檢測蛋白-上海鄭核

一、實驗器材及試劑

1、實驗器材

名稱廠家型號

冰凍切片機ThermoCryotome E

載玻片Servicebio

蓋玻片江蘇世泰實驗器材有限公司10212432C

微波爐格蘭仕微波爐電器有限公司P70D20TL-P4

脫色搖床ServicebioTSY-B

渦旋混合器ServicebioMX-F

掌上離心機ServicebioD1008E

移液槍DragonKE0003087/KA0056573

組化筆Gene techGT1001

冰箱青島海爾股份有限公司BCD-192TGN

顯微鏡CICXSP-C204

2、主要實驗試劑

試劑廠家貨號稀釋比

OCT包埋劑Sakura4583

無水乙醇國藥集團化學試劑有限公司

二甲苯國藥集團化學試劑有限公司

EDTA（PH8.0)抗原修復液ServicebioG1206

EDTA(PH9.0)抗原修復液ServicebioG1203

檸檬酸（PH6.0)抗原修復液ServicebioG1202

PBS緩沖液ServicebioG0002

4%多聚甲醛ServicebioG1101

3%雙氧水ServicebioG0115

BSAServicebioG5001

正常兔血清ServicebioG1209

蘇木素染液ServicebioG1004

蘇木素分化液ServicebioG1309

蘇木素返藍液ServicebioG1340

中性樹膠ServicebioG1403

一抗：

二抗：

組化試劑盒DAB顯色劑ServicebioG1211

二、冰凍切片免疫組化實驗步驟

1、冰凍切片固定：冰凍切片室溫晾干，置于4%多聚甲醛固定10min，于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

2、抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH9.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中低火10-15min，斷電間隔10min轉至中低火10-15min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定）

3、阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。（一抗是山羊來源用10%正常兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加組化試劑盒內與一抗相應種屬的二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。

8、復染細胞核：蘇木素復染3min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，流水沖洗。

9、脫水封片：將切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min --無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

10、顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

三、冰凍切片免疫組化實驗結果判讀

蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。

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拓展知識：