前沿拓展：

2017年11月份，Nature Plants在線發表中國農業科學院環發所崔海信研究員領銜的“多功能納米材料及農業應用”創新團隊同生物所的“作物分子育種技術”創新團隊合作的題為“Pollen magnetofection for genetic modificationwith magnetic nanoparticles as gene carriers”研究論文。

圖. 花粉納米磁珠轉化法原理

該研究基于磁性納米顆粒基因載體的花粉磁珠轉化植物遺傳修飾方法，可以利用磁性納米顆粒Fe3O4作為載體，在外加磁場介導下將外源基因輸送至棉花等物種的花粉內部，通過人工授粉利用自然生殖過程直接獲得轉化種子，然后再經過選育獲得穩定遺傳的轉基因后代。

該方法將納米磁轉化和花粉介導法相結合，克服了傳統轉基因方法組織再生培養和寄主適應性等方面的瓶頸問題，可以提高遺傳轉化效率，縮短轉基因植物培育周期，實現高通量與多基因協同并轉化，適用范圍與用途非常廣泛，對于加速轉基因生物新品種培育具有重要意義，并在作物遺傳學、合成生物學和生物反應器等領域也具有廣泛應用前景。此外，該研究為基因編輯達到DNA-FREE的理想狀態提供了一種可能。

因此，該文章發表后立刻引起了全球各實驗室的關注，并且各實驗室都在嘗試在不同的物種中利用該方法進行轉基因及基因編輯。

但是在2020年11月3日，Nature Plants雜志在線發表了來自俄勒岡州立大學的John E. Fowler等人題為“No evidence for transient transformation via pollen magnetofection in several monocot species ”的研究論文。該研究表明至少在三種單子葉植物（玉米、高粱和百合）中使用前文報道的花粉納米磁珠的protocol進行瞬時轉化都沒有獲得成功。該文也是首次以論文形式公布花粉磁珠轉化方法的負結果，并且通過了同行的評議，正式刊登在Nature Plants雜志上，這對于仍然正在從事該研究有重要參考價值。

該研究首先研究花粉磁珠轉發方法在玉米和高粱這兩種單子葉植物中的有效性。他們通過用GUS報告質粒進行花粉磁珠感染后，通過染色GUS活性來檢測花粉的瞬時轉化效率。研究表明，未轉化的對照高粱花粉粒中的GUS染色也呈陽性（如下圖），因此GUS作為報告基因并不理想。因此該研究使用基于綠色熒光蛋白（GFP）的報告質粒作為替代物。

研究進一步選擇了在花粉中高表達的啟動子的質粒（玉米Zm13，水稻Actin1或玉米ZmUbiquitin1）。通過按照已發表的方案，用高粱或玉米花粉進行的20多次磁轉染試驗未顯示質粒誘導的熒光瞬時表達的跡象（篩選了50,000多粒花粉）。

最后，該研究選擇了百合花粉作為模型，因為在2017年的Nature Plants的文章中表明在百合花粉中實現了轉化。同時可以驗證是否由于質粒原因導致轉化不成功。該研究通過花粉磁珠轉化法和基因槍轉化法兩種方法作為對照。研究結果表明通過用報告質粒進行基因槍轟擊后，轉化效率在0.4％至1.1％之間，平均為0.7％（表1）。如所預期的，在陰性對照中，即用缺乏質粒DNA的微載體轟擊的樣品中，未發現轉化的花粉。但是，盡管篩選了近4,000個花粉粒，在磁轉染處理中也未觀察到轉化的百合花粉（表1），說明該方法并不能在百合花粉中成功實現轉化。

此外，之前我們公眾號iPlants還專門建了交流群，以便從事該領域研究的人員的相互交流（現在如需進群，請掃描下面小編二維碼進群）。

基于此，去年11月份中國農業科學院環發所還發布“關于磁性納米顆粒文章的說明”，將成立專門工作組，對討論的問題進行調查核實！

然而，大反轉出現了！

2022年4月15日，JIPB在線發表了來自北京市農林科學院生物所吳忠義研究員課題組題為“Efficient and genotype independent maize transformation using pollen transfected by DNA-coated magnetic nanoparticles”的研究論文。論文詳細介紹了基于納米磁珠介導的、不依賴基因型的玉米遺傳轉化方法，成功將外源基因轉入玉米中。

該方法借助納米磁珠將外源基因通過花粉萌發孔導入玉米花粉，然后經人工授粉和自然結實過程，將外源基因轉入多種玉米自交系中，成功解決了玉米遺傳轉化過程中“依賴組培體系，嚴重受基因型限制”的瓶頸問題。該方法的成功為其它植物開發花粉轉化體系的提供有力借鑒。

圖1. 納米磁珠介導的不依賴基因型的玉米遺傳轉化流程

A-B. 田間玉米花粉收集；C. 8℃條件下使用轉化液預處理（關鍵步驟）；D. 8℃條件下納米磁珠-DNA轉化花粉（關鍵步驟）；E-F. 花粉干燥；G-H. 授粉結實。

圖2. 花粉萌發孔的打開是外源基因成功導入花粉和幼胚的關鍵

A. 關閉狀態的花粉萌發孔；B. 打開狀態的花粉萌發孔；C-F. 以紅色熒光蛋白基因RFP為報告基因，檢測不同條件下花粉的轉化效率；G-K. 以GUS為報告基因檢測不同條件下，幼胚轉化效率。

吳忠義課題組經過多年不斷探索，建立了納米磁珠介導的不依賴基因型的玉米遺傳轉化方法，并成功解決了該遺傳轉化方法的兩個關鍵問題，使該轉化方法穩定、高效。第一，花粉預處理及轉化的整個過程均在低溫（8℃）條件下進行，保持了花粉的活力，為保證授粉后玉米的結實率提供了保障；第二，使用轉化液在8℃條件下預處理花粉10分鐘，在保持花粉活力的前提下，大幅提高花粉萌發孔打開的效率（達到40%-55%），為納米磁珠-DNA復合體高效進入花粉提供了保障。該研究還發現，溫室中種植的玉米材料，花粉的萌發孔很難被打開，使用該方法難以完成玉米的遺傳轉化。

博士后王作平和副研究員張中保博士為該論文的第一作者，吳忠義研究員和魏建華研究員為通訊作者。該研究得到了北京市科技計劃項目、北京市農林科學院創新能力建設專項和北京市博士后基金的資助。

歡迎大家進行實驗、交流、討論，擴大該方法在其它物種的使用范圍。

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