前沿拓展：

文章來自《A seven-gene-deleted African swine fever virus is safe and effective as a live attenuated vaccine in pigs》，本供參考，如有侵權和不妥，請及時聯系翻譯者刪除或改正！

作者：陳偉業1，趙東明1，西軍何2，劉仁強1，王紫龍1，張憲鋒2，方力1，單珊1，陳鶴峰1，張繼文1，王露露1，文志遠1，王西軍1，關云濤2，劉金雄1＆步志高1,2 *

1中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，哈爾濱150001； 2國家動物疾病預防控制重點實驗室，哈爾濱150069

2020年2月20日收到； 2020年2月27日接受；在線發布于2020年3月1日

非洲豬瘟（ASF）是豬的一種毀滅性傳染病，正嚴重威脅著全球養豬業。因此，急需一種有效的疫苗。在這里，我們使用了中國的ASFVHLJ / 18作為一個基礎，并生成了一系列已刪除基因的病毒。在無特定病原體豬，商品豬和懷孕母豬中的毒力、免疫原性、安全性和保護性功效評估表明，一種已刪除7個基因的病毒，即HLJ / 18-7GD，已被完全減毒，不能轉化為毒株，并提供了對豬致命性野毒的完全保護。我們的研究表明HLJ / -18-7GD是一種安全有效的抗ASFV疫苗，因此有望在控制ASFV的傳播中發揮重要作用。

非洲豬瘟，疫苗，安全性，防護功效，豬

引文：陳文超，趙丹，何新，劉瑞，王中，張新，李，F，山大文，陳紅，張杰（et al2020）缺失基因基因的非洲溫氏熱病毒作為減毒活疫苗在豬中是安全有效的。中國科學生命科學63，https://doi.org/10.1007/s11427-020-1657-9

介紹

非洲豬瘟（ASF）是豬的一種烈性傳染病，對全球養豬業造成了災難性影響。病原體ASF病毒（ASFV）屬于非洲病毒科中的非洲病毒屬。ASFV具有復雜的架構（Wang等人，2019; Alejo等人，2018）和一個大的雙鏈DNA基因組（170-193 kb），包含151-167基因取決于毒株。根據編碼衣殼蛋白p72的B646L基因，ASF被分為24種不同的基因型（Quembo等，2018），所有這些基因型都已在非洲檢測到（Quembo等，2018; Wade等， 2019）。兩個ASFV基因型已經傳播到其他大陸。 I ASFV基因型在1950年代在歐洲出現，并在1990年代中期從大多數歐洲國家根除（Sánchez-Vizcaíno等人，2013; Iglesias等人，2017; Revilla等人，2018）。 II型ASFV基因型于2007年引入佐治亞州，此后在許多歐洲國家流行（Iglesiasetal。，2017; Pejsaketal。，2014）; 2018年，該病毒在中國和其他10個亞洲國家蔓延傳播（Wen等人，2019; Ge等人， 2018; Le等，2019; Kim等，2020）（http://www.oie.int/）。

中國的生豬產量占全球生豬總數的50％以上；然而，在中國，超過99％的養豬場是小型養豬場，每年生產少于500頭豬，并采用了安全的低層次的生物安全措施。盡管ASF暴發似乎是通過宰殺受感染的豬來控制的，ASFV廣泛污染了環境，因此繼續在中國造成了致命的威脅。由于沒有疫苗可用，恢復生豬的成功不太可能。與2018年8月相比，2019年9月中國的生豬產量減少了40％，自2019年8月以來豬肉價格翻了一番。其他亞洲國家的情況可能與此類似。這些事實表明，不能僅通過剔除感染的豬來控制ASF，因此迫切需要開發和應用有效的疫苗。

在過去的幾十年中，已經評估了針對ASF的不同疫苗策略。已對滅活疫苗、DNA疫苗、、亞單位疫苗和腺病毒載體疫苗進行了測試，并證明不成功（Sunwoo等人，2019;Sánchezetal。，2019; Murgiaetal。，2019; Jancovichet等人，2018; Arias等人。 ，2017）。一些基因缺失的ASFV已顯示出作為減毒活疫苗的潛力（Borca等人，2020a; Reis等人，2017; O'Donnell等人，2017; Monteagudo等人，2017; O'Donnell等人， 2015a; O'Donnell等人，2015b），但如果它們能夠在豬中復制過程中轉化為更多強毒株，則未知。在本研究中，我們選擇了中國第一個分離出的ASFV，豬/黑龍江/ 2018（HLJ / 18）（Zhao等人，2019; Wen等，2019; 2019），作為開發減毒活疫苗的基礎。

結果

具有不同基因缺失的ASFV的產生和毒力評估

使用DNA同源重組技術（Reiset等人，2017; Monteagudoetal。，2017; O'Donnelletal。，2015a），通過刪除基因編碼的ASFVs的產生和毒力評估，我們通過刪除編碼1至7種不同蛋白的基因片段（包括MGF505）構建了6種不同的病毒-1R，MGF505-2R，MGF505-3R，MGF360-12L，MGF360-13L，MGF360-14L，CD2v，9GL，DP148R和UK以前已證明對不同ASFV的毒力很重要（Reis等等人，2017; O'Donnell等人，2017; Monteagudo等人，2017; O'Donnell等人，2015a; Zsak等人，1998; Reis等人，2016）。在初級豬肺泡巨噬細胞（PAMs）中純化了缺失基因的攜帶病毒的基因和mCherry，經序列分析證實，并命名為HLJ / 18-6GD（編碼六種蛋白質的基因MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、 MGF360-13L和MGF360-14L），HLJ / 18-CD2vdel（刪除編碼CD2v的基因），HLJ / 18-DP148R-del（刪除DP148R基因），HLJ / 18-9GL＆UK-del（刪除9GL和UK基因） ，分別刪除了HLJ / 18-CD2v＆UK-del（CD2v和UK基因）和HLJ / 18-7GD（基因編碼MGF5051R，MGF505-2R，MGF505-3R，MGF360-12L，MGF36013L，MGF360-14L和CD2v的基因）（圖1A）。

HLJ / 18病毒在豬中具有高度致死性（Zhao等，2019），其50％的豬致死劑量（PLD50）為1.7 50％的血吸附劑量（HAD50）（圖1B）。為了研究這些缺失基因的病毒是否減毒了豬，我們給三到六只7周齡無特定病原體（SPF）的豬肌肉注射了103和105 TCID50的基因缺失病毒，并觀察了三周。接種后21天（p.i.）監測體溫和存活率。如圖1B所示，用HLJ / 18-DP148Rdel接種的所有豬均在9天內死亡，其中50％–100％的HLJ / 18-CD2v-del或HLJ / 18CD2v＆UK-del接種的豬發燒，這些組中有50％–75％的豬死亡在3周的觀察期內，所有接種HLJ / 18-6GD，HLJ / 18-9GL＆UK-del或HLJ / 18-7GD的豬均保持健康并在3周的觀察期內存活（圖1B，表1）。這些結果表明，HLJ / 18DP148R-del在豬中具有致死性，HLJ / 18-CD2v-del和HLJ / 18-CD2v＆UK-del則對豬具有輕度減毒作用，而HLJ / 18-6GD，HLJ / 18-9GL＆UK-del和HLJ / 18-7GD在豬中顯著減弱。減毒的ASFV對豬的強效HLJ / 18攻擊的保護效力為了研究減毒病毒是否能誘導保護性免疫，分別使用了HLJ / 18-6GD-，HLJ / 18-9GL＆UKdel和HLJ / 18-7GD接種的豬用200 PLD50的HLJ / 18病毒肌內（im）攻擊;同事，四個類似的10周大的SPF豬陰性對照。每天記錄2 1天的體溫和存活率。從死豬和存活的豬中收集血液，器官和組織，包括心臟，肺，脾，扁桃體，胸腺和五個淋巴結（腸淋巴結，腸淋巴結，上頜下淋巴結，支氣管淋巴結和胃肝淋巴結），將其在攻擊后第21天（pc）安樂死以通過qPCR進行病毒DNA定量。對照組和HLJ / 18-9GL＆UK-del接種組中的豬均在12天的時間里發燒并死亡（圖2A）;在這些豬的血液，器官和組織中檢測到病毒DNA的高拷貝（圖2B和C）.HLJ / 18-6GD和HLJ / 18-7GD接種組在觀察期的整個過程中均存活（圖2A）；在這些組的豬的某些器官或組織中檢測到了病毒DNA（圖2D和E）。值得注意的是，在HLJ / 18-7GD接種組中，病毒DNA復制的速度比其他組低。 在103個TCID50和105個TCID50 HLJ / 18-6GD接種組中，每只豬的發燒分別持續9天和6天（表2）。 103 TCID50 HLJ / 18-7GD接種組中的所有四頭豬發燒，但是105 TCID50 HLJ / 18接種組中只有一頭豬發燒接種7GD的組發燒1天（表2）。這些結果表明，HLJ / 18-9GL＆UK-del不誘導任何保護作用，而HLJ / 18-6GD和HLJ / 18-7GD具有免疫原性，能夠保護豬免于致命的ASFV攻擊。這些數據還表明，HLJ / 18-7GD誘導的保護作用與劑量有關，而HLJ / 18-6GD誘導的保護作用與劑量無關。

HLJ / 18-6GD和HLJ / 18-7GD在減毒疫苗有效與否的最大關注中的安全性評價

疫苗種毒可在復制的動物中轉化為強毒株，因為兩種早期活疫苗是通過在細胞培養中通過連續傳代或從自然分離的無毒株減毒毒株而開發的，并轉化為致死毒株，在其繁殖過程中造成了10％-50％的死亡率在1960年代在葡萄牙和西班牙的種豬中應用這種方法（Coggins等，1968； Ribeiro等，1963）。根據中國減毒活疫苗開發指南（http://www.moa.gov.cn），必須在目標動物中通過有效傳代的疫苗株五次傳代，以評估適應動物的種子株是否能更有效地復制。為此，將六只SPF豬群肌肉內接種了107 TCID50的HLJ / 18-6GD和HLJ / 18-7GD病毒，并觀察了21天。分別在第5、10和15天時從豬中收集了血樣。在第21天p.i.處死安樂死的每只豬，收集脾臟和淋巴結。通過qPCR檢測病毒DNA。在接種了HLJ / 18-6GD的組中，在5頭豬的血液和1頭豬的脾臟中檢測到病毒DNA（表3）。然而，在接種了HLJ / 187GD的組中，沒有收集到任何樣本中檢測到病毒DNA（表3）。所有的豬在3周的觀察期內都存活了下來。

我們下邊采集了豬的四個階段的HLJ / 18-6GD陽性血清。分別在第5、10和15天p.i.采集血樣，并于21 p.i.每天從每個豬皮下收集器官和組織，包括心臟，肝臟，脾臟，肺，腎，扁桃體，胸腺和淋巴結，以檢測病毒DNA。我們發現，HLJ / 186GD病毒在豬中逐步更有效地復制，這是由于血液中病毒DNA拷貝數增加以及接種了第5代病毒的組織分布豬的表現所致（圖3A–D，表3）。值得注意的是，有一只HLJ / 18-6GD病毒的第5代患豬病情嚴重并在11天死亡。 （圖3F，表3）。在當天下午5點之前洗掉的那只豬的血被接種了5頭更多的豬，并且高矮的豬（第6代）在其血液和器官中有高病毒DNA拷貝，其中4人發燒，其中1只表現出嚴重的疾病癥狀，并在p.i第13天死亡。 （圖3E和F，表3）。這些結果表明，HLJ / 18-6GD病毒在豬中復制過程中可能具有更高的毒性。

我們還粗略地通過了HLJ / 18-7GD接種豬的病毒DNA陰性血液進行了四次傳代，但在從這些豬中采集的任何樣品中均未檢測到病毒DNA（表3）。為了進一步研究HLJ / 18-7GD在豬中的復制，對14只7周齡SPF豬接種了107.7 TCID50的高劑量疫苗，并在第2、5、8、10、12、16和21天對兩只豬實施了安樂死pi。收集這些豬的血液和器官以進行病毒DNA檢測。如圖3所示，未在任何豬的血液，心臟，肝臟，脾臟，肺，腎臟，扁桃體或胸腺中檢測到病毒DNA，但在分別于第5、8、10、12和16天安樂死的一或兩只豬的某些淋巴結中檢測到了DNA。（圖3G）。將具有最高病毒DNA拷貝數的淋巴結勻漿并接種到另外四頭豬中，并在p.i第8天對兩只豬實施安樂死。其余10只在當天晚上10點進行安樂死。收集這些豬的血，器官和淋巴結進行病毒DNA檢測。如圖3H所示，在第10天p.i.安樂死的一只豬的兩個淋巴結中檢測到病毒DNA，但在從其他三頭豬收集的任何樣品中未檢測到（圖3H）。在隨后接種了病毒DNA陽性淋巴結勻漿的任何隨后的豬中均未檢測到病毒（數據未顯示）。這些結果表明，肌肉注射后，HLJ / 18-7GD病毒僅在豬的短期特定淋巴結內得以維持，并且在豬的其他任何器官都沒有出現臭味；因此，HLJ / 18-7G不太可能轉化為無毒的重組誘因，因此我們選擇了針對該疫苗的HL-7 / J評估疫苗。 ASF并在清潔商業豬中進行了其他研究。

HLJ / 18-7GD對商品豬的強效HLJ / 18攻擊的保護效力由于單劑疫苗誘導的保護性免疫作用可能在數周內下降，因此在實際的動物疾病控制實踐中可能需要第二劑。除了肌內攻擊外，我們還評估了口服挑戰豬的保護作用，因為口服途徑主要是豬如何自然感染ASFV。將一組來自當地農場的7周齡仔豬轉移到P2設施中，并兩次（間隔3周）接種105 TCID50的疫苗，然后將其移動至P4設施以在疫苗接種后的不同時間進行攻擊。將四到五只相似的未接種疫苗的豬作為對照組。對所有豬用致死性HLJ / 18病毒攻擊后三周進行觀察，從死豬和存活的豬中采集的樣本包括血液，心臟，脾臟，肺，扁桃體，胸腺和淋巴結，在第21天進行了安樂死。收集用于qPCR的病毒DNA檢測。值得注意的是，所有攻擊研究中的對照豬都在攻擊后11天內死亡，并且在這些豬的所有測試器官中均檢測到高病毒DNA拷貝數（圖4，表4）。

如圖4A所示，在接種后的105TCID50疫苗和挑戰劑量為HLJ / 18日的18日當天接種的豬均存活了3周的觀察期，但在HL的血液，扁桃體和2個淋巴結中均檢測到病毒DNA，這表明在5豬的GH /結束時，在其上的第一個/末期的2個淋巴結中檢測到了病毒。 18-7GD對種豬和SPF豬均提供類似的保護。

將兩組豬接種105 TCID50的疫苗兩次：一組在當天早晨接受了攻擊。第二次免疫后兩周用200 PLD50的HLJ / 18免疫，另一組在第二次免疫后三周用106.5的HLJ / 18的HAD50口服。所有接種疫苗的豬都存活了3周，在i.m.的一頭豬的一個淋巴結中檢測到非常低的病毒DNA水平。挑戰組（圖4B）；口服攻擊組中的任何豬均未檢測到病毒DNA（圖4C）。這些結果表明，用105 TCID50 HLJ / 18-7GD進行的兩次免疫接種可提供對豬致命HLJ / 18攻擊的固體保護。

商品豬通常飼養至少五個月。當我們對一組在五個月內（上次接種疫苗后80天）用105 TCID50 HLJ / 18-7GD疫苗接種過兩次的豬進行攻擊時，我們發現其中80％在攻擊中存活了下來，但是持久的免疫力無法有效清除挑戰病毒（支持信息中的圖S1）。圖2中的數據表明HLJ / 18-7GD誘導的保護與劑量有關，因此，我們調查了較高的接種劑量是否可以誘導更好的長期保護。為此，我們給六頭豬接種了一組106 TCID50劑量的疫苗，并在接種后10周對豬進行了攻擊。我們發現，所有接種疫苗的豬都保持健康，并在觀察期內存活下來，并且在兩只不同豬的一個淋巴結中檢測到低水平的病毒DNA，而在其他四只豬中未檢測到（圖4D）。這些結果表明，單劑HLJ / 18-7GD的106 TCID50誘導的持久免疫力可提供針對致命ASF攻擊的可靠保護，并且建議同時服用HLJ / 18-7GD的106 TCID50的兩劑可以保護豬一生。

妊娠母豬中HLJ / 18-7GD的安全性評估

在實踐中，為控制ASF，母豬也需要接種疫苗。接種疫苗的潛能始終會引起懷孕問題。因此，我們研究了該疫苗在懷孕母豬中的安全性。六個一胎懷孕不同階段的母豬接種106 TCID50的HLJ / 18-7GD母豬：在懷孕的第35天（妊娠）接種一頭母豬，在懷孕的第94天（妊娠）接種兩頭母豬，在懷孕的第63天（治療中的妊娠）接種三頭母豬（不計妊娠）（表5）。從接種當天到分娩后的四個星期，每天對母豬進行監測。接種后所有母豬均保持健康，并在預期日期交付仔豬（表5），這表明接種HLJ / 18-7GD不會對懷孕母豬造成疾病或流產或影響仔豬的健康。

討論

已鑒定出ASFV的幾個基因與毒力相關，缺乏這些基因的病毒已被評估為潛在疫苗，但沒有一個被完全評估過安全性（Borca等人，2020a; Reis等人，2017; O'Donnell等人，2017; Monteagudo等人，2017; O'Donnell等人，2015b; O'Donnell等人，2015a）。 刪除DP148R基因可降低豬中貝寧97/1分離株（基因型I病毒）的毒性（Reis等人，2017），但刪除DP148R基因不會減弱HLJ / 18病毒。 CD2v基因的缺失在體內高度減弱了強毒BA71株（基因型I病毒）（Monteagudo等人，2017），但在本研究中略微減弱了HLJ / 18病毒; 然而，最近的一項研究報道，CD2v基因的缺失并未減弱Georgia / 2010株（基因型II株）（Borca等人，2020b）。 另一項研究報道了ASFV Georgia / 2007（基因型II株）刪除了9GL和UK基因后，對豬是安全的，并且可以保護豬免受同源病毒的攻擊（O’Donnell等，2017）；但是，具有相似缺失的HLJ / 18病毒（HLJ / 18-9GL＆UK-del）在豬中減毒，但沒有提供針對同源病毒攻擊的任何保護作用。這些發現表明，ASFV毒力的分子基礎可能在菌株之間有所不同，并且在一種菌株中，由一種ASFV菌株的基因缺失引起的生物學變化可能與其他菌株不同。

與ASFV Georgia / 2007和Benin97 / 1（Reisetal。，2016; O'Donnelletal。，2015a）的發現相似，缺失MGF360和MGF505基因的HLJ / 18-6GD在豬中也被減弱，并且保護豬免受用強毒的父母病毒進行攻擊；但是，我們的安全性評估數據表明，HLJ / 18-6GD具有高風險轉化為毒株，因此，不應該選做疫苗。幸運的是，對于HLJ / 18-7GD病毒，通過刪除CD2v基因可以消除這種風險。

先前的研究表明，ASF疫苗適應細胞系后很容易喪失免疫原性，并且不能賦予豬抵御同源病毒攻擊的保護力（Sánchez等人，2019; Gallardo等人，2018; Krug等人，2015），這表明ASF疫苗應在原代細胞中生產據報道，豬骨髓（PBM）細胞支持ASFV復制（Malmquist and Hay，1960）。我們發現PBMs支持growthofHLJ / 18-7GDwell，并且從一個SPF小豬衍生的PBM可以生產至少200,000劑疫苗（106 TCID50 /劑量）。此外，我們發現HLJ / 18-7GD在PBM中連續傳6代后仍保持其免疫原性（數據未顯示）。因此，使用主要用于大規模生產HLJ / 18-7GD的PBM是可行且具有成本效益的。

綜上所述，我們以中國ASFV HLJ / 18為骨干，產生了6個帶有不同基因缺失的病毒，發現具有7個基因缺失的HLJ / 18-7GD在豬中被完全減毒，轉化為弱毒株的風險較低。 并可能在豬中產生抵抗致命ASFV攻擊的固體保護作用。 HLJ / -18-7GD已經過全面評估，并被證明對ASFV安全有效。我們預計該疫苗將在ASFV的控制中發揮重要作用。

材料和方法

倫理聲明

本研究嚴格按照《中華人民共和國動物科學技術部動物保護與使用指南》中的建議進行。該方案已由動物實驗倫理委員會批準，哈爾濱市獸醫研究所（HVRI）中國農業科學院（CAAS）和黑龍江省動物倫理委員會。

生物安全性聲明和設施

在由農業和農村事務部以及中國合格評定國家認可服務局批準的CAAS HVRI的增強的生物安全性3級（P3 +）和4級（P4）設施中，所有活ASF病毒實驗均在增強的生物安全級3（P3 +）和4級（P4）設施中進行。

細胞培養，病毒和豬

從30–40天大的無特定病原體（SPF）的豬中收集初級豬肺泡巨噬細胞（PAM），并將細胞在10％FBSRPMI1640培養基（Thermo Scientific，美國）中于37°C和5 ％CO2。使用豬PBMC分離試劑盒（中國TBD科學公司），用EDTA處理過的豬血制備了外周血單個核細胞（PBMC）。如前所述收集豬骨髓（PBM）細胞（Malmquist and Hay，1960）。如前所述（Zhao等人，2019），從中國的田間樣品中分離出ASFV豬/黑龍江/ 2018（HLJ / 18）。用于挑戰性研究的HLJ / 18儲備液是用病毒接種的SPF豬的去纖維化血液制備的，并在PAM中進行滴定。

SPF大白豬和長白豬雜交的豬是從HVRI的實驗動物中心獲得的。從當地農場獲得清潔的商業豬和懷孕母豬，對它們進行測試以確保它們對豬呼吸道和生殖綜合癥（PRRS），經典豬瘟（CSF），ASFV和偽狂犬病病毒（PRV）呈陰性。

基因缺失的ASFV的產生

親本ASFV HLJ / 18基因組與重組轉移載體通過轉染和感染過程進行同源重組，從而產生基因缺失的ASFV。重組轉移載體包含側翼基因組區域軟靶標邊緣，在這些缺失部分的左右兩側映射約500–1,000bp，并帶有報告基因盒。如圖1所示，使用了含有eGFP或mCherry的報告基因以及ASFV p72晚期基因啟動子或CD2v基因啟動子的重組載體。通過融合PCR和Gibson Assembly技術（Invitrogen Life Sciences，美國）構建重組轉移載體。通過使用TransITLT1轉染試劑（Mirus Bio，Madison，WI，USA）用構建的轉移載體轉染PAM，然后在轉染后24h用HLJ / 18感染，如前所述（稍有修改（Reis等，2017; O'Donnell et al。，2015a; Monteagudo et al。，2017; O'Donnell et al。，2015b）。這些構建在病毒基因組中產生了預期的缺失，如圖1所示。 HLJ / 18-9GL＆UK-del，HLJ / 18-CD2v＆UK-del和HLJ / 18-7GD具有病毒基因組的兩個缺失部分，是通過兩次連續的同源重組程序構建的。通過依次挑選熒光噬菌斑并在PAM單層上進行有限稀釋，將每個同源重組事件產生的病毒純化。從最后一輪純化中獲得的病毒在PAM中被擴增，從而成為病毒原種。為了確保在每個重組基因組中不存在親本HLJ / 18和所需的缺失，從病毒原種中提取病毒DNA，并通過PCR和測序進行確認。

病毒滴定

如前所述，通過使用溶血（HAD）分析對野生型HLJ / 18病毒進行了定量（Malmquist and Hay，1960）進行了一些細微修改。 PBMC接種在96孔板中。然后將樣品加入板中，并使用10倍系列稀釋液進行一式兩份的滴定。在接種后第7天（p.i.）測定HAD，并使用Reed and Muench（Reed and Muench，1938）

方法計算50％HAD劑量（HAD50）。通過檢測它們的50％組織培養物感染劑量（TCID50）對從基因缺失的ASFV感染的豬細胞上清液中的樣品進行定量。將PBMC接種到96孔板中，三天后，將10倍連續稀釋的樣品一式三份添加到每個孔中。培養7天后，通過熒光顯微鏡（AxioObserver.Z1，Zeiss，德國）評估熒光蛋白的表達。通過使用Reed和Muench的方法計算TCID 50。

定量PCR

通過使用GenElute?哺乳動物基因組DNA Miniprep試劑盒（美國Sigma Aldrich）從細胞上清液，組織勻漿或EDTA處理的外周血中提取ASFV基因組DNA。根據OIE推薦的程序，在QuantStudio 5系統（美國Applied Biosystems）上進行qPCR。

豬的研究

為了確定HLJ / 18的50％豬致死劑量（PLD50），將5組四只50天大的SPF豬肌內（im）接種10倍系列稀釋液，這些稀釋液含有100到104份HAD50病毒，體積為1mL 。每天對豬進行21天的溫度和死亡率監測。使用Reed和Muench的方法計算PLD50。

為了評估基因刪除的ASFV在豬中的毒力，將50天大的SPF豬的i.m.用每種測試病毒的103 TCID50和105 TCID50接種，每天監測豬的溫度和死亡率，持續21天。

若要評估基因刪除的病毒對豬ASFV病毒的攻擊的防護效果，請對豬進行分組。用指示的劑量的ASFV兩次接種m。然后在指定的時間點用致死性HLJ / 18病毒攻擊。將類似的未處理的老化豬作為對照。攻擊后（p.c.）每天對豬進行21天的臨床體征和死亡率監測。根據OIE的建議，收集在觀察期結束時被安樂死的死豬或成活豬的血液，器官和組織，包括心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、扁桃體、胸腺和淋巴結，以通過使用qPCR檢測病毒DNA進行收集

遵循《 2019年陸生動物診斷測試和疫苗手冊》（https://www.oed.org/en/OIE）中所述的OIE的建議。

對基因缺失的ASFV作為減毒活疫苗在豬中的安全性評估

HLJ / 18-6GD和HLJ / 18-7GD在SPF仔豬中的安全性進行了評估。 .oie.int / standard-setting / terrestrial-manual / access-online /）和中國減毒活疫苗開發指南（http：// www。moa.gov.cn/nybgb/2006/dbq/201806/t20180616_6152332。htm ），并進行細微修改。簡而言之，用107 TCID50的測試病毒肌內接種每組六頭豬。在下午5、10和15天從豬身上采集的血液樣本。并于當天21p.i.對豬進行了安樂死以收集DNA進行病毒DNA檢測。從經HLJ / 18-6GD接種的豬中收集的病毒DNA陽性血樣用于接種豬，以供隨后傳代。由于未從任何接種HLJ / 18-7GD病毒的豬中檢測到病毒DNA，因此在p.i的第5天和第10天從豬中收集了合并的血樣。被用于接種豬以供隨后的傳代。

為了進一步評估HLJ / 18-7GD在豬中的安全性，我在當天上午對14只50天大的SPF豬進行了評估。分別用HLJ / 18-7GD的107.7 TCID50接種，然后分別在第2、5、8、10、12、16和21p.i.天對兩只豬實施安樂死，并采樣其血液，心臟，肝臟，脾臟，收集腎臟，扁桃體，胸腺和六個淋巴結（腸淋巴結，腹股溝淋巴結，支氣管淋巴結，上頜下淋巴結，胃肝淋巴結和縱隔淋巴結）進行qPCR檢測病毒DNA。收集病毒陽性器官或樣品，均質化，然后用于接種隨后的豬。第三次傳代后的豬病毒DNA陰性。將它們的淋巴結匯合，勻漿，然后再接種四只SPF豬（第四代）。每天監測豬的體溫和臨床體征，持續21天，然后對其進行安樂死以收集血液以及指定的組織和淋巴結進行病毒檢測。

HLJ / 18-7GD在妊娠母豬中的安全性

為了確定HLJ / 18-7GD在妊娠母豬中的安全性，從當地一家養豬場購買了八頭處于不同妊娠階段的初生母豬。一頭母豬早孕期（妊娠第35天），兩頭母豬后期妊娠（妊娠第94天）和妊娠中期（妊娠第63天）以HLJ / 18-7GD的106TCID50接種。未接受母豬兩次妊娠作為對照。每天對所有母豬進行溫度監測和臨床體征，直到仔豬分娩后四個星期。

合規與道德作者聲明不存在利益沖突。

致謝

我們感謝Susan Watson編輯手稿。這項工作得到了國家重點研發計劃（2018YFC1200601），黑龍江省應用技術研究與發展計劃（GA19B301），廣東省重點領域研究與發展計劃（2019B020211004）和國家重點項目的資助獸醫生物技術計劃實驗室（SKLVBP201801）。

拓展知識：